涂片要多久(血涂片染色)
第一章 血液样本采集和血涂片制备
一、血液生理概要
1.血液组成
血液标本类型
①全血 适用于临床血液学检查。
②血浆 全血 抗凝剂 离心 适用于内分泌激素、血栓与止血检查。
③血清 全血 离心（静置） 适用于临床化学和免疫学检查。
不加抗凝剂，血清缺少某些凝血因子，如凝血因子Ⅰ（纤维蛋白原）、Ⅱ（凝血酶原）、Ⅴ、Ⅷ等。
血浆与血清的区别 2.血液理化性质
①血量：正常人血量约为（70±10）ml/kg体重，成人约4～5L，约占体重的6%～8%。
②颜色：严重CO中毒或氰化物中毒者血液呈樱红色。餐后，尤其是高脂膳食后，血浆呈乳白色。溶血患者血浆呈红色。
③酸碱度：pH 7.35～7.45
3.血液特性：悬浮稳定性、黏滞性（纤维蛋白原、球蛋白）、凝固性。
4.血液生理功能：具有运输功能、协调功能、维护机体内环境稳定和防御功能。
（一）静脉采血法
1.概述
通常采用肘部静脉、手背静脉、内踝静脉或股静脉。小儿可采颈外静脉血液。为避免血小板激活，要使用塑料注射器和硅化处理后的试管或塑料试管。
（二）皮肤采血法（毛细血管采血法）
1.概述
部位→手指（WHO推荐左手无名指指端内侧）和耳垂。
2.操作方法
（1）准备：取合适试管，加适量稀释液。取微量吸管和乳胶吸头相连，检查连接处是否漏气，或取一次性微量吸管备用。
（2）按摩：轻轻按摩左手中指或无名指指端内侧，使局部组织自然充血。
（3）消毒：用75%乙醇棉签擦拭采血部位，待干。
（4）针刺：用左手拇指和食指固定采血部位使皮肤和皮下组织绷紧，右手持一次性消毒采血针自指端腹内侧刺入，深度2～3mm，立即出针。
（5）拭血：待血液自然流出后，用无菌干棉球擦去第1滴血。
（6）吸血：用一次性微量吸管吸血，然后用无菌干棉球压住伤口止血。如血流不畅，可用左手自采血部位远端向指端稍施压使血液流出。
（7）稀释：用无菌干棉球擦净微量吸管外部，将吸管伸入装有稀释液的试管底部，慢慢排出吸管内的血液，并用上清液冲洗管内余血2～3次，最后将试管内的液体混匀。 3.注意事项
①所选择采血部位无烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症等。
②本试验具有创伤性，必须严格按无菌技术操作，防止采血部位感染，做到一人一针一管，避免交叉感染，最好用一次性器材。
③皮肤消毒后，应待75%乙醇挥发后采血，否则流出的血液扩散而不成滴。
④因第1滴血混有组织液，应擦去。如血流不畅切勿用力挤压，以免造成组织液混入，影响结果的准确性。
⑤进行多项检查时，采血的顺序依次为血小板计数、红细胞计数、血红蛋白测定、白细胞计数等。【口诀-SUN】
静脉肘部是首选，放血别忘拔针头，皮肤通常选手指，婴儿踇趾或足跟，多项检查小板先。 （三）真空采血法
真空采血装置有套筒式、头皮静脉式两种。真空定量采血容器，根据需要标有不同的色码，适于不同检验项目。
常用彩色真空采血容器的用途
盖子颜色
红色
无添加剂
凝块形成约30～60min
化学、血清学、血库
紫色
EDTA
须颠倒混匀6～8次
全血细胞计数（CBC）
淡蓝色
枸橼酸钠
须颠倒混匀；血液与抗凝比例为9:1
凝血检查（PT、APTT、因子测定）
绿色
肝素钠、肝素锂、肝素铵
根据实验需要，选择不同类型的肝素
化学
灰色
氟化钠
不能用于其他化学检查
葡萄糖、糖耐量
黄色
多茴香脑磺酸钠
须颠倒混匀8次
血培养
黑色
枸橼酸钠
血液与抗凝剂比例为4：1
血沉
质量控制
1.患者：患者活动情况、精神状态、药物、年龄、性别、种族、样本采集时间、吸烟、季节等都会影响检测结果。
2.采血：止血带结扎时间应小于1分钟，如超过2分钟，大静脉血流受阻而使毛细血管内压增高，使分子质量＜5000的物质逸入组织液，或缺氧引起血液成分的变化，使检查结果增高或减低。
3.溶血：因容器不洁、接触水、强力振荡、操作不慎等可引起溶血，使红细胞计数、血细胞比容、血浆或血清化学成分（如钾、镁、转氨酶、胆红素）等多项指标检验结果发生变化。
4.样本处理：血液样本采集后应立即送检，并尽快进行检查，样本保存不当直接影响实验结果。血浆在4℃保存24h后，某些凝血因子活性减少95%。低温（4℃）保存血液可使血小板计数结果减低。因此，应根据实验项目确定最佳的保存条件。
5.实验结果分析：分析结果时，应考虑药物、饮食等因素对结果的影响。同时，应密切结合临床。
三、抗凝剂选择
1.乙二胺四乙酸（EDTA）盐
常用有钠盐或钾盐。
①抗凝原理：螯合钙离子。
②使用方法：量为1.5～2.2mg/ml血液。
③适用范围：对血细胞形态、血小板计数影响很小。
根据国际血液学标准化委员会（ICSH）建议，CBC抗凝剂用EDTA-K2。不适于凝血检查、血小板功能试验。
2.草酸盐
①抗凝原理：草酸钙沉淀。
②适用范围 双草酸盐
血细胞比容、CBC、网织红细胞计数等检查。
不适于血小板计数、白细胞分类计数。 3.肝素
①抗凝原理：
加强抗凝血酶（AT）灭活丝氨酸蛋白酶，从而阻止凝血酶形成，并阻止血小板聚集等作用，从而阻止血液凝固。
②使用方法：每毫升血液肝素用量为（15±2.5）U，多为肝素钠盐或钾盐。
③适用范围：红细胞渗透脆性试验。
不适于CBC、细胞形态学检查。 4.枸橼酸盐
①抗凝原理：能与血液中钙离子结合形成螯合物。
②使用方法：配成109mmol/L的浓度。
1:9------凝血
1:4------红细胞沉降率
③适用范围：凝血检查、红细胞沉降率、输血保养液。
四、血液涂片制备
一张良好的血片
①厚薄适宜
②头体尾明显
③细胞分布均匀
④血膜边缘整齐
⑤并留有一定空隙
血涂片的制备
①手工推片法 25°～30°夹角
血滴大小、推片与载玻片间夹角、推片速度、血细胞比容。 ②厚血膜涂片法 疟原虫、微丝蚴等。
五、血液细胞染色
瑞氏染色法
1.染料组成
染料组成
酸性染料伊红（E-） 钠盐 阴离子
碱性染料亚甲蓝（M＋） 氯盐 阳离子
将适量伊红、亚甲蓝溶解在甲醇中。
甲醇的作用：一是溶解亚甲蓝和伊红；二是固定细胞形态。
2.染色原理 物理吸附与化学亲和作用
③中性颗粒 呈等电状态与E-和M 结合→淡紫红色
④红细胞
原始红细胞、早幼红细胞胞质、核仁，染成较浓厚的蓝色；中幼红细胞既含酸性物质，又含碱性物质，染成红蓝色或灰红色；完全成熟红细胞，酸性物质彻底消失后，染成粉红色。 3.pH值的影响
细胞各种成分均属蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液pH而定，在偏酸性环境中正电荷增多，易与伊红结合，红细胞和嗜酸性粒细胞染色偏红，细胞核呈淡蓝色或不染色；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝结合，所有细胞呈灰蓝色，颗粒呈深暗，嗜酸性颗粒呈暗褐，甚至棕黑色，中性颗粒偏粗，呈紫黑色。
①pH＜pI→Pr带正电荷多→易与E-结合→染色偏红
②pH＞pI→Pr带负电荷多→易与M 结合→染色偏蓝
磷酸盐缓冲液（pH6.4～6.8）
保证细胞受色时恒定最佳pH条件 4.注意事项
（1）血涂片干透后固定，否则细胞在染色过程中容易脱落。
（2）冲洗时应以流水冲洗，不能先倒掉染液，以防染料沉着在血涂片上。冲洗时间不能过久，以防脱色。如血涂片上有染料颗粒沉积，可滴加甲醇，然后立即用流水冲洗。
（3）染色过淡可以复染，复染时应先加缓冲液，然后加染液。染色过深可用流水冲洗或浸泡，也可用甲醇脱色。
六、方法学评价
1.血涂片制备
用血量少、操作简单，是应用最广泛的方法。
疟原虫、微丝蚴等检查可采用厚血膜涂片法。
2.血液细胞染色
瑞氏染色法：最经典、最常用。对于细胞质成分、中性颗粒等可获得很好的染色效果，但对细胞核的着色能力略差。
吉姆萨染色法：对细胞核、寄生虫（如疟原虫等）着色较好，结构更清晰，但对细胞质成分的着色能力略差。
瑞-吉姆萨复合染色：使细胞胞质、颗粒、胞核等均获得满意的染色效果。
瑞氏染料的质量规格用吸光度比值（rA）来评价。
新配制染料rA接近2，降到（1.3±0.1）染料即可使用。
新鲜配制的染料偏碱，须在室温或是37℃下贮存一定时间，待亚甲蓝逐渐变为天青B，贮存时间愈久，染色效果愈好。在贮存过程中，必须加塞，以防甲醇挥发和氧化成甲酸。所用甲醇须为AR级，若其中含过多丙酮，会使染色偏酸，白细胞着色不良。
七、质量控制
1.血涂片制备
血滴愈大、角度愈大、推片速度愈快，血膜愈厚，反之则愈薄。
血细胞比容增高、血液黏度较高时，采用小血滴、小角度、慢推；血细胞比容减低、血液较稀时，应采用大血滴、大角度、快推。
2.血液细胞染色
染色深浅与血涂片中细胞数量、血膜厚度、染色时间、染液浓度、pH值密切相关。 血清与血浆的区别是
A.血清缺少某些凝血因子
B.血浆缺少某些凝血因子
C.血清缺少凝血酶
D.血浆缺少凝血酶
E.血清缺少纤维蛋白
『正确答案』A
『答案解析』血清与血浆的差别是：血清缺少某些凝血因子，如凝血因子Ⅰ（纤维蛋白原）、Ⅱ（凝血酶原）、Ⅴ、Ⅷ等。
婴幼儿做血常规检查时，多使用的采血部位是
A.颈外静脉
B.耳垂毛细血管
C.足跟毛细血管
D.肘部静脉
E.以上都是
『正确答案』C
『答案解析』手指采血操作方便，检查结果比较恒定，世界卫生组织（WHO）推荐采集左手无名指指端内侧血液，婴幼儿可采集大踇趾或足跟内外侧缘血液，严重烧伤患者，可选择皮肤完整处采血。
下列说法错误的是
A.采血前要仔细检查针头是否安装牢固
B.采血前要仔细检查针筒内是否有空气和水分
C.使针头与皮肤成30°角斜行快速刺入皮肤
D.抽血时针栓可以外抽和内推
E.取下注射器针头，将血液沿试管壁缓缓注入抗凝管中
『正确答案』D
『答案解析』抽血时只能外抽，不能内推。
导致溶血的因素不包括
A.抽血速度太快
B.血液注入容器时未取下针头
C.注入抗凝管后剧烈振荡混匀
D.注射器干燥
E.取血后直接放入4℃冰箱
『正确答案』D
『答案解析』注射器中有水会导致溶血，干燥不会。
血液标本4℃保存，可使血液分析仪
A.红细胞计数结果减低
B.红细胞分布宽度增加
C.血小板计数结果增加
D.血小板计数结果减低
E.白细胞计数结果减低
『正确答案』D
『答案解析』血浆在4℃保存24h后，某些凝血因子活性减少95%，低温（4℃）保存血液可使血小板计数结果减低。
影响血涂片时血膜厚度的因素有
A.血滴大小
B.血黏度高低
C.推片角度
D.推片速度
E.以上都是
『正确答案』E
『答案解析』制备涂片时，血滴愈大、角度愈大、推片速度愈快，血膜愈厚，反之则愈薄。血细胞比容增高、血液黏度较高时，应采用小血滴、小角度、慢推，可得满意结果；血细胞比容减低、血液较稀时，应采用大血滴、大角度、快推。
瑞氏染色中起溶解作用的有机溶剂是
A.无水乙醇
B.甲醇
C.氯仿
D.二甲苯
E.乙二醇
『正确答案』B
『答案解析』瑞氏染色中甲醇的作用：一是溶解亚甲蓝和伊红；二是固定细胞形态。
下列有关瑞氏染色法的叙述中，哪项是正确的
A.是酸性染料亚甲蓝和碱性染料伊红组合的复合染料
B.细胞核被染成红色
C.新鲜配制的染料可以马上使用
D.对细胞的染色原理仅有正负电荷的作用
E.是血涂片染色最常用的方法
『正确答案』E
『答案解析』瑞氏染色法：是最经典、最常用的血涂片染色方法。对于细胞质成分、中性颗粒等可获得很好的染色效果，但对细胞核的着色能力略差。
